第二章　细胞凋亡

自从20世纪中叶人类发现细胞是构成生物体的基本单位后，就认识到细胞的死亡在生物到高等生物（主要是动物界），在其生长中占有重要的地位。1842年，Vost等人第一次在两栖类动物变态发育中观察到细胞自然死亡。随后发现，从低等生物到高等生物（主要是动物界），在其生长发育的过程中，均有细胞自然死亡现象。1966年，Tata等人发现在两栖类动物变态发育过程中，RNA和蛋白质合成抑制剂放线菌酮可以抑制细胞的自然死亡，这提示这种死亡可能需要大分子物质的合成。1964年，Lockshin和Willians第一次提出了程序化细胞死亡（programmed cell death，PCD） ^［1］这一概念。PCD主要用来表述在生物的生长发育过程中，细胞在预定的地点发生死亡的现象。但随后便被证明，某些类型的PCD可被某些物质阻止，揭示PCD是可以避免发生的。

随着对细胞超微结构的深入研究，1972年爱丁堡大学病理学者Kerr、Wyllie和Currie ^［2］首次提出了细胞凋亡（apoptosis）这一概念。apoptosis一词源于希腊语，原义为“apo=脱离”与“ptosis=落下”，即指秋叶凋落而言。Derr等人指出凋亡是一种在形态上不同于坏死的细胞死亡方式，是由基因控制的细胞自我消亡过程。

1980年，Wyllie等在用糖皮质激素诱发的胸腺细胞死亡研究中首先发现，细胞出现凋亡时核小体之间的连接部双螺旋断裂形成多个180～200bp的寡核苷酸碎片，在含溴化乙锭（C ₂₁H ₂₀BrN ₃）的琼脂糖凝胶电泳上呈典型的“梯状”条带，这一过程是由激活的钙离子依赖的核酸内切酶介导的。而坏死时，常常是由细胞损伤因子引起的DNA无规律的断裂，伴组蛋白降解，在琼脂糖凝胶电泳上呈模糊的弥散状索带。虽然最近一些作者发现凋亡时不一定发生DNA的断裂，但目前仍认为琼脂糖凝胶电泳时核DNA的梯状条带为PCD的特征性变化。

1986年，Ellis和Horvitz在研究秀丽隐杆线虫发育中的PCD时，发现了真正调控死亡的基因。这一发现，迅速地使人们给予PCD广泛重视。1993年，Yucm等人发现一些线虫的死亡基因与哺乳动物的某些基因具有同源性。随着对PCD的了解，人们对PCD的意义不断扩展。目前认为，只要是细胞内某种死亡程序所介导的细胞死亡无论何种原因触发，也无论是否完全表现出细胞凋亡的特征，都称其为PCD。

研究揭示，细胞凋亡普遍地存在于各种正常和异常的生物过程。在胚胎和胎儿期，四肢芽形成足、翅膀的肌肉骨骼发育中，以及出生前的生殖系统和神经系统所发生的形态学变化中，细胞凋亡都起了决定性作用。

关于造血过程中的PCD：1992年，Koung推测凋亡在造血发育中也起作用。出生前造血位置的变换与凋亡有关。出生后，老化骨髓造血功能的丧失可能是凋亡的结果，造血过程中凋亡的存在和抑制可能与移植的造血干细胞克隆性增殖分化、再障贫血及造血系统肿瘤的发生有关。

而后，关于细胞凋亡的基因（机制）、凋亡与某些疾病、凋亡与肿瘤治疗方面的研究日趋深入明了。

1995年，张鹏等报道了自1992年始应用三氧化二砷（As ₂O ₃）治疗急性早幼粒白血病（APL）临床和实验研究 ^［3］发现As ₂O ₃对APL不仅有诱导分化、克隆抑制作用，而且还有促进凋亡作用，观察到APL细胞凋亡的形态学表现，特别是同时有细胞核的空泡退变。As ₂O ₃治疗APL开创了诱导肿瘤细胞凋亡治疗肿瘤的先例，创立了“肿瘤凋亡”治疗学 ^［4］。继而，关于砷剂诱导凋亡的研究迅速展开。1996年，上海瑞金医院与我们等多个单位协作，利用分子生物学等方法观察到As ₂O ₃能有效地降低NB ₄细胞中BCL-2基因的表达，而显著诱导NB ₄凋亡。

Apoptosis是细胞死亡的一种形式。它是一个形态学概念，其形态学主要特征是染色质固缩，细胞质空泡变性（我们研究发现细胞质空泡变性时胞核也有空泡变性）及核碎裂DNA片段（180～200bp）形成——核碎裂。最近的一些研究发现凋亡时不一定发生DNA断裂。

Kerr等人提出凋亡的细胞一般呈单个散在，早期胞体缩小，染色质固缩，常聚集于核膜呈境界分明的颗粒块状或新月形小体。继而胞核和细胞外形皱缩，核裂解成质膜包绕的碎片，胞膜突出形成质膜小泡——细胞“出泡（blebbing）”现象，脱落后形成凋亡小体，其内可保留完整的细胞器和致密的染色质。组织中的凋亡小体则迅速地被巨噬细胞或邻近细胞摄取消化，因此无明显的炎细胞浸润。

细胞发生坏死时，首先胞体肿大，进而细胞破裂乃至死亡。而细胞在凋亡过程中，胞体不是膨大而是缩小，故起初人们称之为“缩小坏死”，后来才改为“细胞凋亡”。

与细胞凋亡相关的是“程序化死亡”（PCD）这一概念。在多细胞生物体的发生、发育过程中，为了保持细胞的数量和组织的稳定均衡状态，有必要控制细胞的增殖和死亡。同时在细胞的分化、器官和脏器形成过程中，许多细胞也要发生死亡而被消除。这种死亡是由于自身基因启动“死亡程序”而引起注定的死亡（自我毁灭——自杀），称为“程序化细胞死亡”，应该认为PCD是机体在自我控制（生理）的机制下发生的细胞凋亡。由于PCD在表现上与apoptosis一样属于“缩小坏死”，与坏死（necrosis）的膨胀坏死有根本不同，故许多学者都把PCD与apoptosis两个概念等同起来，赋予相同的意义。但后来人们发现，apoptosis的意义远超出PCD，它不仅限于正常组织的发生、分化以及细胞转化等生理过程，也与癌细胞退缩，放射线照射及抗癌作用表达和以艾滋病为主的病毒感染性疾病所致的淋巴细胞减少等诸多疾病过程有密切关系。而且发生在上述疾病过程中的凋亡的一切特征表现又与PCD有着明显区别，故我们认为，apoptosis的概念应分为广义与狭义两种，狭义的apoptosis是意指上述病理过程中出现的一种有别于坏死的一种胞体缩小的意外死亡方式，而广义的概念则应包括生理过程中的PCD含义在内。

基于上述，关于细胞死亡，我们建议如下分类：

一个原始细胞（更早期为多向干细胞或干/祖细胞）增殖发育到成熟阶段后达到生存期而死亡。如一个原始红细胞分裂、发育到成熟红细胞，生存120天左右后死亡；原始粒细胞发育到杆状或分叶后2～4天寿终正寝；原始淋巴细胞→幼稚淋巴细胞→成熟淋巴细胞后，寿命很短，约一天左右死亡，原始巨核细胞→幼稚巨核细胞→颗粒型巨核细胞→成熟巨核细胞，将全部血小板释放后变成裸核而死亡。这类均属于衰老性死亡（自然死亡）。衰老性死亡可以凋亡形式或者坏死形式实现。

细胞未发育成熟或者虽然发育成熟而未达到寿命（生存期）的中途死亡（过早死亡）。非衰老性死亡可有三种形式：

正常存活的细胞（指正常组织细胞或病理组织细胞如肿瘤）由于窒息而即刻死亡。其特点为死亡时刻细胞形态无显著变化，嗜染台盼蓝。如固定液处理后的外周血、骨髓、活检组织、脱落细胞或穿刺液的细胞等。

细胞发生坏死时，细胞膜的通透性增大，核及线粒体等细胞器发生膨胀，ATP产生减少，细胞内渗透压调节障碍，Na ⁺、K ⁺泵转运功能降低，钠水大量进入细胞，继而溶酶体破裂，其释放的蛋白水解酶进一步使细胞溶解——死亡，坏死细胞的周围组织常常发生炎性反应。

细胞发生凋亡时，首先是染色质压缩，染色质凝集，呈现块状致密染色区，然后核逐渐裂解，胞体缩小，密度增大，一部分核连同一定比例的核糖体、细胞器及一部分细胞膜包被，形成凋亡小体，脱落，被有吞噬能力的细胞清除。多数类型细胞在凋亡的最后阶段发生细胞核DNA降解，按185bP的片段逐步切割下去，因此在琼脂糖凝胶电泳上可看到有特征性的梯形图谱。广义的apoptosis可分为：

（1）程序化死亡（PCD）——生理性。

（2）狭义的凋亡apoptosis：病理性的凋亡，人们提到的凋亡apoptosis通常是指狭义的apoptosis。

程序性死亡、凋亡与坏死的区别见表2-1。

细胞凋亡实际上是细胞的一种自杀过程，它为消除不再需要的细胞提供了一个有效的机制。当细胞生长得过多了，或是出于生长发育的需要，或是由于细胞发生了异位迁移时，细胞都可发生凋亡以保持整体的稳定，当病毒侵袭细胞，或是外界因素引起DNA的改变时，细胞也会有选择地牺牲部分细胞来杀灭病毒和防止癌变。

凋亡受内外环境中各种因素的影响，细胞外环境中非正常物质的出现，正常物质的缺乏、细胞内环境的改变均可产生凋亡，并受细胞内储备信息传递系统和某些基因的调控。如：Ca ²⁺、蛋白激酶C（PKC）及神经酰胺等。一般认为，凋亡是在外界某些因素诱导下，经细胞内信息系统传递，促使死亡基因表达死亡蛋白，通过蛋白酶的作用而引发的。但也有学者认为凋亡不必有新的蛋白质合成，死亡蛋白原本就以前体方式存在于细胞质中，只需以一个信号就可以激活并发挥作用。细胞凋亡的机制较复杂尚待深入研究。

端粒是位于真核细胞染色体末端的一种特殊结构。它在染色体末端像帽子一样保护着染色体，防止其断裂，并帮助核膜黏着及生殖细胞在减数分裂时的配对。它是由染色体的末端DNA和末端DNA结合蛋白所形成的复合物。端粒DNA是由许多短的正向重复序列组成，可长达10kb以上，重复序列长约5～8bp，如人的端粒重复片段为TTAGGG，四膜虫的重复片段为GGGTT。端粒能稳定染色体末端，避免染色体重组和末端被降解。再者，在真核细胞的DNA复制过程中，RNA引物在复制结束后水解消失，造成两个子代分子中均有一个S′端缺少一段核苷酸，而没有一个DNA聚合酶能填补，细胞面临S′端隐缩的问题。而端粒的存在能缓冲这一隐缩趋势，从而维持染色体的正常功能。在细胞分裂中，端粒的长度随分裂次数的增加而不断缩短，导致染色体稳定下降，直至细胞衰老，并发生生理性死亡——细胞凋亡。在这一过程中，端粒起到了分子钟的作用，计数着分裂次数，调整着多细胞生物体内的新老交替。在细胞分裂到一定次数后，可以发现这些细胞的染色体显示未融合，有时出现染色质浓缩降解，产生若干大小不一的寡核苷酸碎片，最后细胞死亡。因此，有人提出染色体的端粒改变可作为apoptosis的早期生物学标志。

端粒酶是一种不依赖于α-DNA聚合酶和DNA模板的核糖核蛋白，它行使反转录酶功能，合成端粒DNA。在端粒酶内部，存在着一段RNA序列，能编码端粒DNA重复片段。它合成端粒片段的可能机制如下：端粒酶上的非模板RNA部分与细胞DNA上原有端粒结构配对结合，然后再以模板RNA部分进行反转录合成端粒，以维持端粒的长度。

如前所述，端粒以自身长度的缩短调节着细胞的正常死亡，而端粒酶却以补充端粒的缩短部位来干扰这种正常调节机制，致使某些细胞获得不死的特性，这种状况可能与癌症的发生有关。

经研究发现，在人体正常组织细胞中端粒酶的活性为阴性。在生殖细胞中则具有活性，对端粒长度进行补充以维持生殖细胞的增殖能力。而在肿瘤细胞中，端粒的长度可长可短，但端粒酶的活性是阳性的。有人观察到，在有的肿瘤细胞中，端粒变短，于是提出了这与端粒酶活化相矛盾的疑问。但Counter等跟踪一转化SV ₄₀或腺病毒DNA的细胞时证实，细胞在逃避分裂极限的危机期（死亡期）时端粒大量丢失，但端粒酶活化，细胞无限增长，因此，肿瘤细胞中端粒长度与端粒酶活化并不矛盾。

端粒通过自身长度的逐步缩短调节细胞发生凋亡，维持多细胞体的平衡，而端粒酶通过补充端粒来打破平衡，使细胞逃避凋亡。这一发现对肿瘤的治疗具有一定的积极意义。

许多资料表明，细胞凋亡的激发与抑制是受遗传因素影响的，有多种基因参与细胞凋亡的基因调控。其中有的基因对凋亡可同时具有诱导和抑制双重作用，随自身产物数量的多少和其他条件的不同而变化。表2-2列出了一些对细胞凋亡有调控作用的基因，其作用是相对一般情况而言的。

在表2-2的这些基因中，一部分为癌基因，一部分为应用减数杂交等方法，从凋亡细胞中分离的特异性细胞凋亡相关基因。关于这些基因详细的作用机制，目前尚不完全清楚，现扼要叙述如下。

BCL- 2原癌基因是目前最受关注的与细胞凋亡关系密切的基因之一，其主要作用是抑制细胞凋亡。它由3个外显子组成，通过不同的RNA剪接产生两个开读框，编码239个氨基酸组成的分子量为22kD的BCL-2β蛋白，这两个蛋白除C-末端之外完全相同，且无信号肽。Bcl-2蛋白的C-末端有一由19个氨基酸组成的疏水性片段，可能导致BCL-2蛋白附着于细胞内膜结构上。这段片段对其功能极为重要，若改变其中的氨基酸会使其蛋白活性大大降低。人的 BCL- 2基因通常位于第18号染色体上，但在某些B细胞淋巴瘤病人中易位到第14号染色体上，与免疫球蛋白的重链位点连接起来，形成融合基因。易位后并不影响蛋白质编码，但表达量大增，可能系免疫球蛋白的重链基因增强子的作用的缘故。

BCL- 2基因的抑制凋亡作用并不在于改变细胞增殖的速度，而是通过抵抗多种形式的细胞死亡，延长细胞寿命，导致细胞数目增加。

Vaux等人在转基因细胞实验中发现，BCL-2的过量表达可使多种造血细胞及前B细胞在多种逆境下延长生存时间，如在去除生长因子、去除血清、γ-射线、钙离子载体、糖皮质激素、 Myc基因过量表达等情况下。而对于神经细胞来说，它的编程死亡可能有两条或更多的途径，其中有的可由 BCL- 2基因产物阻断，如Garcia等人证明，BCL-2过量表达能阻止去除神经生长因子（NGF）而导致的交感神经细胞的编程死亡；而对有的途径，BCL-2则不起作用，如对依赖于纤毛神经营养因子（NTF）的纤毛神经细胞。再者，Nunez等人还发现 BCL- 2的抗凋亡作用对依赖于IL-3或IL-4或FM-CSF（粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子）的造血细胞株有效，而对依赖于IL-2或IL-6的细胞株无效。还有过量表达BCI-2的转基因小鼠的胸腺中依然存在负选择现象。一种以细胞编程凋亡为主的过程，BCL-2对此类细胞无保护作用。

用免疫组化方法研究发现， BCL- 2基因蛋白表达产物位于线粒体膜、核膜和内质网膜上。关于它的作用机制目前有三种说法：

（1）加强细胞中 BCL- 2基因的表达，发现高浓度的BCL-2蛋白可抑制细胞内质网中钙离子的释放，因此认为BCL-2对细胞的调节可能是通过影响内质网中钙的释放来实现的。

（2）通过直接或间接地与信号传递蛋白（如P ₅₃蛋白）作用而调节细胞死亡。

（3）通过调节抗氧化途径来抑制细胞的编程死亡，一般认为，放射线导致的细胞凋亡是通过放射线的间接作用——生成活性氧等有害因素形成的。而BCL-2蛋白质的定位膜系又是活性氧的生成系。虽然其详细结构尚不清楚，但经实验发现， BCL- 2基因表达多的细胞对放射线抵抗性强。最近，科学家已阐明BCL-2蛋白质确与抗氧化途径有关，它是通过阻断活性氧自由基的形成而使细胞免于凋亡的。

1933年，Borse等发现了另一类BCL家族中的成员——BCL-X，其分两种：BCL-X _L、BCL-X _S，后者的作用与BCL-2和BCL-X _L相反，并通过抑制前两者的作用而引起细胞编程死亡。

1933年，Oltvai等用免疫沉淀法检测到Bax蛋白，并发现BCL-2与Bax两者形成一对正负调控，它们之间的比例决定了细胞是否接受诱导凋亡的信号。但此两者并非控制细胞凋亡的唯一决定者。在体内外，BCL-2与Bax可形成二聚体。当细胞中Bax蛋白高表达时形成同源二聚体，即可加速细胞的编程死亡。Bax基因的作用机制目前尚不清楚，有人认为，它的表达并不立即导致细胞的编程死亡，而是仅在细胞接受死亡信号后，才通过抑制BCL-2的作用而导致细胞凋亡。

Bak基因是最新发现的Bel-2家族成员，它对Bcl-2有抑制作用，类似Bax/Bcl-2。但Bak不能与Bd-2形成异源二聚体，它对Bel-2的抑制作用可能是通过其他蛋白质信号传递途径为中介而起作用的。

由于Bak可与EIB19K蛋白相互作用，而后者参与核骨架中核纤层作用，因此认为Bak可能通过E1B19K蛋白或其他蛋白与核物质作用而调控细胞死亡。

已知 myc家庭共有7种基因： C- myc、 N- myc、 L- myc、 B- myc、 S- myc、 N- myc2、 myc- L ₂，其中与凋亡有关的基因是 C- myc及 S- myc。

C- myc基因是癌基因的一种，可促进细胞增殖，抑制细胞分化，同时，在某些因素作用下引起细胞凋亡。因此， C- myc被认为是具有诱导增殖和apoptosis双重作用的基因。其作用的选择是由其他信号，如生长因子的存在或其他激活刺激所决定的。C-myc是促进细胞由G ₀/G ₁期转到S期的转录刺激因子，它一方面激活那些介导细胞增殖的基因，另一方面也激活那些诱导凋亡的基因。目前认为由于C-myc蛋白中促进细胞凋亡与促进细胞增殖的功能区是同一区，C-myc的表达只提供一个细胞增殖或凋亡的信号，需要有第二个生长信号刺激后才能抑制细胞凋亡，促进细胞进入增殖状态，若没有第二个信号则进入凋亡。因此，富有成效的细胞增殖要求有另外一股力量来积极抑制凋亡。血清，生长因子、丝裂原等可能的表达和关键生长通过激活相应的信号转录系统抑制凋亡，促进增殖。C-myc的表达和关键生长因子获得与否决定了三种细胞状态：生长抑制（C-myc不表达，生长因子缺如）；增殖（C-myc表达，生长因子存在），凋亡（C-myc表达，生长因子缺如）。

S- myc是 myc基因家庭的成员之一，其表达产物是具有促进DNA复制活性的DNA结合蛋白。与 C- myc表达产物相比，其结构中酸性区缺少蛋白酶磷酸化的位点，故其基因缺乏转化能力，易诱导细胞凋亡。 S- myc不像 C- myc那样对许多细胞起作用，其细胞特异性强，在中枢神经系统的发生过程中常见 S- myc基因表达。

P ₅₃基因是一种重要的抗癌基因，它位于第17号染色体短臂，具有11个外显子，编码393个氨基酸。它的编码蛋白是一种细胞内蛋白，可与各种DNA或蛋白结合对转录进行调控。正常 P ₅₃两侧等位基因同时出现点突变等变异时失去活性，一侧缺乏同时对侧出现变异则细胞癌变。变异型 P ₅₃与正常型 P ₅₃相比具有极高的代谢稳定性，癌细胞蛋白水平明显增高。

正常型 P ₅₃可促进凋亡，而突变型 P ₅₃可抑制凋亡，将正常的 P ₅₃基因转染至无 P ₅₃基因的白血病细胞中，则发现细胞出现凋亡。

同 C- myc一样， P ₅₃并不是凋亡必不可少的调控基因，但它对因DNA损伤而诱发的凋亡反应却是不可缺少的，有学者认为 P ₅₃基因在这种凋亡过程中起到了一种分子感受器的作用。当DNA受到各种基因毒剂而损伤时，正常 P ₅₃表达增加，与DNA结合，诱导细胞进入G ₁期，抑制细胞增殖，使受损细胞获得修复DNA的时间。如果DNA受损严重，无法修复，则P ₅₃蛋白持续增高，引起凋亡。而突变型P ₅₃蛋白不能制止细胞增殖并减少凋亡，含有受损或错配DNA的细胞不能消除，可成为生长失控的癌细胞前身。

由于细胞凋亡过程中，常出现特有的形态学改变及一系列生理生化变化，因此可根据凋亡细胞的特征性改变检测凋亡的发生。常用的研究方法包括：

由于普通光镜难以定论细胞凋亡是否为原位发生，而且细胞凋亡的形态学变化仅在几分钟内，形成凋亡小体后仅在被吞噬前几个小时内可以观察到，因此电镜观察形态学是确认凋亡十分可信的方法，特别对不一定发生DNA断裂的凋亡的细胞可能更有意义。

细胞凋亡形态改变是首先胞体变圆，随即与周围细胞脱离，失去微绒毛，胞质浓缩，内质网扩张突显泡块并与细胞膜结合，核染色质凝集成半月形，贴近核膜，核仁裂解，进而细胞膜内陷将细胞分隔为多个内膜完整包裹，内涵物不会外溢的凋亡小体。

但由于形态学观察常不能排除主观性，使电镜应用价值受到一定的限制。

对于活体细胞，可应用甲苯胺蓝、藏红等作细胞学染色。也可用Hoescht33342或吖啶橙等进行荧光染色，在荧光显微镜下观察。观察可见PCD碎片及凋亡小体的存在。

此法是最常用的简便方法。通过Bouius液固定组织，然后进行Feulgen染色可使光镜下凋亡细胞固缩染色质的染色深度增加。根据坏死细胞有RNA降解，而凋亡对mRNA增加的特点，MOHit最近提出了甲基绿-派诺宁染色区分细胞凋亡与坏死的方法。

由于凋亡时常伴有组织细胞某些酶学或蛋白表达的变化，因此一些学者提出通过酶组化方法检测组织中SGP ₂蛋白，组织蛋白酶D或谷氨酰胺转移酶活性以反映细胞的凋亡情况，但是这些方法特异性不强，一些组织细胞发生凋亡并不一定会有这些标志物的变化。

最近研究发现细胞表面Fas抗原可能为细胞凋亡的特异标志，利用抗人Fas单抗，可以检测凋亡的发生。1994年，美国OHCOR公司率先推出了辣根酶标记和荧光标记的Apotag试剂盒，这可能为细胞凋亡的研究提供较大的方便。

细胞出现凋亡时，核小体之间的连接部位双股螺旋断裂，形成多个180～200bp的寡核苷酸碎片。培养或单细胞悬液用细胞裂解液消化，经常规方法提取基因组DNA后，在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上出现最典型的“梯状”条带。因而琼脂糖凝胶电泳法成为检测细胞凋亡的经典方法。为提高检测的灵敏度，现已提出以下几种改进方法：

1992年，ROSL利用凋亡细胞在核酸内切酶作用下产生具有黏性的末端DNA片段，可被Klenow聚合酶补平的原理，采用 ³²P标记的核苷酸对纯化的DNA通过简单的末端标记放射自显影，便可检测梯状条带中的核苷酸片段。该法尤其适合于微量核苷酸碎片的检出。

1992年，Huang和Plunkett等报道了可以定量检测Pg水平PCD细胞核小体间DNA碎片的方法。细胞消化裂解后，抽提并纯化细胞DNA，用碱性磷酸酶将DNA末端脱磷酸后，在T ₄多核苷酸激酶的作用下将5′末端标记，琼脂糖凝胶电冰后，通过测定DNA带的放射量推知细胞凋亡的程度。该法比单纯溴化乙锭染色琼脂糖凝胶电泳的敏感性要高2000倍。

1993年，Wijsman等首先报道，石蜡包埋的切片组织用蛋白酶消化后在DNA聚合酶或Klenow聚合酶的作用下将生物素标记的核苷酸原位掺入DNA裂口，再用辣根酶标记的抗生物素蛋白抗体作用后，经DAB显色可使凋亡细胞呈阳性着染。由于阳性反应的坏死细胞有DNA的降解，在形态上与凋亡细胞明显不同，故在光镜下容易区分。

TUNEL是1992年由Ganridelie等人发表的，它是将“TDT置于片段化的DNA 3′-OH端部位，具有构型非依赖性和碱基结合的功能”用于组织化学的一种方法，这使人们能够将此方法应用于甲醛固定石蜡包埋的切片上。

步骤：

（1）脱蜡：0.01M PBS（pH7.2），洗净（2分钟）。

（2）蛋白分解酶的处理：20µg/ml proteinase K（sigma-chemical，st louis Mo.），室温，15分钟（冷冻切片时用，此处不采用）去离子水洗净。

（3）内源性过氧化物酶的抑制：0.3%H ₂O ₂加甲醇，室温，30分钟，去离子水洗净（2分钟，4次）。

（4）TdT反应：25U/µl TdT，0.2µl及1nmol/µl biotingla-ted16-duTP，0.5µl TdT，共同加入TdT缓冲液中，至30µl 37℃，60分钟［TdT缓冲液含30mM Trizmabase pH 7.2，140mM甲砷酸钠及1mM氯氏钴。明胶：50µg/ml去离子水配制。TdT及biodnglated16-duTP由Bochringer Mamheim Biochemica，Mamcheim，Geniany提供］。

（5）终止反应：2×SSC（300mM氯化钠，30mM枸橼酸钠）室温，15分钟。

（6）3%牛血清白蛋白加0.01M PBS（pH7.2）室温，10分钟，用0.01M PSS（pH7.2），洗净（2分钟，1次）。

（7）过氧化酶共轭新生霉素（DAKO，Glostrup，Denmank）反应，室温30分钟，0.01M PBS（pFH7.2）洗净（2分钟，4次）。

（8）用DAB-H ₂O ₂发生的过氧化酶呈色反应，室温，10分钟。

（9）5%甲基绿溶液中进行核染色［胸腺及淋巴结（生发中心）等的淋巴组织具有此染色特性，故用做阳性对照］。

TUNEL法对于各种组织在生理、病理方面的细胞动态分析有所帮助。另一方面，虽然坏死变性的细胞常呈阳性反应，但必须慎重地判别假阳性现象。一个明显的例子即在绒毛组织梗阻部位，可见块状的反应一致的TUNEL反应阳性区。而且，水肿改变严重的绒毛间质细胞也呈现弥漫性阳性反应结果。

利用外源性末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）将生物标记的dVTP连接到断裂DNA的3′-OH端，然后用流式细胞仪测定DNA降解情况，或用免疫组织化学染色后普通光学显微镜观察标记的细胞，此法优点是：

（1）灵敏：有的凋亡细胞DNA的双链中仅单位链断裂，这时电泳看不到“梯形泳带”，但ISEL呈阳性。

（2）不仅用于悬浮细胞检测，还可用于组织切片。

（3）可用于观察单个细胞。

（4）可进行凋亡细胞的定量分析。

PCD时，DNA断裂，在流式细胞光度计上呈现亚二倍体核型峰的特征，为与坏死的细胞区分，1994年Huschtscha等用碘化Propidium染色皮细胞光散射的特点提出了检测PCD并使之与坏死相区别的方法。在DNA直方图上，PCD细胞出现二倍体峰（G ₁细胞）的减少，G ₁峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型。而坏死时，细胞周期中的细胞均出现不同程度的减少，亚二倍体细胞量多少不等。在光散图谱上，PCD出现低于正常的向前散射和较高的侧散射，坏死时则呈单一的侧高散射。如果样本中既有凋亡细胞，也有死亡细胞，则在光散射图谱上出现PCD和坏死两种特征性峰型，该法尤其适用于研究抗癌药物诱导细胞死亡机制。

此外，陈功星等建立无血清培养条件下检测PCD方法：用5μg/ml牛血清的蛋白、lμg/ml人转铁蛋白、8μg/ml胰岛素、20μg/ml胆固醇和20μg/ml过氧化氢酶为血清替代物，这可能避免血清中的浓度不定的激素和细胞因子对细胞凋亡的抑制或促进作用，影响检测结果。

多细胞机体体内平衡的维持，不仅依赖于细胞增殖和分化，而且还由细胞自杀过程来参与调控。随着对细胞凋亡研究的深入，人们逐渐认识到其重要的临床意义。无论对疾病机制的认识，还是对疾病的治疗，细胞凋亡均为之开辟了一片新的研究领域。

对于肿瘤的发生，人们一直认为是细胞增殖和分化的异常。而1967年Lvevsen却提出，肿瘤的发生不仅仅是细胞增殖导致的失衡，也可以看做是细胞死亡大大减少导致的失衡。“凋亡”概念一经提出，即很快被引入肿瘤的研究中，尤其发现了癌基因及抑癌基因对细胞凋亡的显著作用，更加印证了肿瘤的发生与细胞凋亡密切相关。1993年，Leosach等提出细胞的存活（viability）和生长（growth）是两个完全不同的调控过程，细胞因子如IL-6、IL-1可诱导细胞存活，避免凋亡，延长细胞生存时间而不促其生长。1994年，Wright等人以10种致癌物质如DDT、DES、PMA、4α-P等作用于7种不同的细胞株发现均可抑制细胞凋亡，致癌物质剂量相对大时可快速出现凋亡抑制效应，剂量小时延长作用时间亦可完全抑制细胞凋亡，阻止DNA断裂。Shulte Hermennet等 ^［5］对大鼠的研究发现也支持这一点。没有证据表明肿瘤细胞是不朽的，当肿瘤细胞生存和繁殖之间的平衡倾斜于增殖时，肿瘤细胞株即可被传代培养。然而癌细胞仍保持着可被不同激活的“自杀程序”，而且可被多种因素抑制，如：生存因子、致癌物质、 bcl- 2基因等。癌细胞的转移可能首先在更加能抵制细胞凋亡的特殊组织，这些特殊组织中可能存在着更为适宜的存活因子抑制肿瘤细胞的凋亡。关于细胞凋亡在肿瘤发生中的具体机制至今无完整的认识，目前有两种假说：①凋亡对细胞的选择假说：在淋巴分化成熟过程中，95%的前淋巴细胞通过细胞凋亡形式而死亡，只有约5%的细胞经选择后存活下来，并发育为成熟的淋巴细胞。如果在发育过程中，大量的前淋巴细胞不发生凋亡，则幼稚细胞大量堆积导致肿瘤的发生。②不凋亡细胞脆性假说：如果让应该凋亡的细胞生存下去，则该细胞的染色体会不稳定，基因易突变，对致癌剂易感性增高，增加恶变机会。如 P ₅₃基因缺失时，细胞凋亡减少，则机体自发肿瘤增加，而且对癌基因转化作用亦加强。尽管以上假说仍须具体化，但毫无疑问细胞凋亡在肿瘤发生中意义重大，有待进一步揭示。

化疗是肿瘤综合治疗的手段之一，随着对细胞凋亡机制的深入了解，人们愈来愈清楚传统的化疗药物是通过相类似的机制起作用。自1993年Kaufmann等发现足叶乙苷可诱导HL-60细胞出现聚ADP核苷多聚酶（poly-ADP-ribose-polymerase，PARP）裂解，导致DNA断裂。大量研究表明，许多抗肿瘤药物杀伤肿瘤细胞的作用是通过启动细胞凋亡机制完成。目前认为化疗药物通过以下几种途径介导细胞凋亡：①依赖P ₅₃介导细胞凋亡：野生型P ₅₃是细胞内“分子警察”，当细胞受到某种药物或放疗作用后，造成细胞DNA的损伤，受损细胞启动共济失调，毛细血管扩张突变基因（gene mutated in ataxia-telangiectasia，MAT）使P ₅₃表达增加，引起细胞G ₁期阻滞以完成修复或进入凋亡以清除肿瘤细胞，这是化疗药物诱导细胞凋亡的常见机制；②Fas/FasL介导：Fricscn等发现在人T细胞白血病，阿霉素和甲氨蝶呤能诱导Jurkat细胞FasL表达，促使周围Fas表达的肿瘤细胞凋亡；③Bcl-2介导：Haider报道紫杉醇通过Bcl-2磷酸化抑制Bcl-2功能促进细胞凋亡。新近研究表明细胞内Bax与Bcl-2/Bcl-x _L比值是决定化疗敏感性的重要因素；④神经酰胺介导：神经酰胺是细胞凋亡信号调控中的第二信号分子，许多应激刺激，包括化疗药物，如阿霉素能激活神经鞘磷脂循环产生神经酰胺，导致多系细胞发生凋亡。

经典的化疗药物多通过核酸和微管损伤诱导凋亡，大多作用于线粒体上游阶段。最近发现的一些抗肿瘤新药，如三氧化二砷、betulinic acid和Lonidamin则直接作用于线粒体，从理论上能够绕过线粒体上游的传导阶段直接触发凋亡，从而克服由于信号传导障碍引起的耐药。

已有报道将野生型 P ₅₃基因经反转录病毒转染至肿瘤细胞能够增加对化疗的敏感，利用Bcl-2反义寡核苷酸导入肿瘤抑制Bcl-2蛋白功能也能促进细胞凋亡。此外，也有人寻找和设计模拟P ₅₃和开发基于Bcl-2蛋白结构与功能的抗肿瘤新药。

肿瘤不仅是一种细胞增殖紊乱的疾病，同时也是凋亡缺陷疾病，近年来以病变信号系统为靶点设计抗肿瘤新药已成为一个热门的研究领域，细胞凋亡中的信号转导分子已成为抗肿瘤治疗的新靶点，凋亡药理学悄然形成，酪氨酸激酶抑制剂、PKC抑制剂等都显示出较好的抗肿瘤活性。

白血病是一种以基因变异为基本病变本质的疾病，细胞凋亡之相关基因与白血病的关系已经逐渐为人们所认识，其中以 bcl- 2、 C- myc、 P ₅₃、 PML- RAR、 bcr- abl等基因最为引人注目。

bcl- 2基因是由迁本等在1985年从滤泡性淋巴瘤发现的伴有t（14；18）的基因。 bcl- 2基因在正常组织也可比较多地表达，特别是在淋巴系统和神经系统组织中更为显著。已知 bcl- 2基因与其他原癌基因不同，它对细胞增殖没有明显的作用，但却能延长细胞的寿命。

许多白血病患者及一些白血病细胞株高表达bcl-2。在AML中，M ₁、M ₂亚型的bcl-2表达高于M ₃、M ₄、M ₅亚型，并且高表达者生存时间短，化疗效果差。体外研究也显示，bcl-2高表达明显延长白血病细胞生存时间，抑制或阻断多种因素，包括P ₅₃、C-myc、化疗药物、撤除生长因子等所触发的细胞凋亡。bcl-Xc（bcl-2家族中的一员）也可能在白血病发病中起作用，一些细胞株如K ₅₆₂无bcl-2，但bcl-Xc高表达。转基因实验提示bcl-Xc阻止细胞凋亡，延长生存时间，增强其耐受促凋亡刺激。

Brukitt淋巴瘤和急性淋巴母细胞白血病（ALL-L ₃）伴有染色体易位t（8；14）（q24；q32），存在于8q24的 C- myc基因与14q32的免疫球蛋白H（IgH）基因，在14号染色体上发生结合，使 C- myc基因被活化。在其他白血病及各种癌细胞中也大量表达 C- myc基因。 C- myc基因产物是局限在细胞核的转录促进因子，它促进细胞以G ₀/G ₁期向S期移行；另外，它同 ras基因的平衡失调，也可促使细胞癌化。

在成纤维细胞系中， C- myc基因能诱导细胞凋亡，而在白血病细胞中，表达失控的 C- myc不能诱导凋亡，却能增强细胞对诱导凋亡的化疗药物的敏感性。突变的P ₅₃因能抑制C-myc的增强作用，bcl-2也能抑制C-myc的增强作用，高表达C-myc一方面诱导细胞凋亡，另一方面促进细胞增殖，抑制细胞分化，Myllie认为它有双向调节作用，这取决于细胞是否沿着细胞周期自由运动。C-myc的表达是与细胞的高周转状态一致的。在这种状态中细胞的增殖与PCD共存，受 bcl- 2与 P ₅₃基因的影响，一方面bcl-2表达使得细胞以高周转状态转变为迅速的细胞群扩展；另一方面，表达C-myc的细胞又由P ₅₃诱导凋亡。

癌抑制基因 P ₅₃有两型，一型是使细胞周期停止在G ₁期，抑制细胞增殖的野生型；另一型是具有转化能力的变异型，在无表达 P ₅₃基因的小鼠红白血病株，分别导入野生型和变异型的 P ₅₃基因时，在变异型其细胞增殖无变化，而野生型则可诱导细胞凋亡。另外，通过分析 P ₅₃基因缺乏小鼠发现，细胞凋亡存在着P ₅₃依赖性（X、Vp-16诱导的）和非依赖性（糖皮质激素、钙诱导的）。

在白血病中，已知有P ₅₃基因失活的病例。慢性髓细胞性白血病在急性转化时，一般认为有约10%左右的病例其17号染色体的等臂染色体作为异常的附加染色体，这意味着 P ₅₃基因17P位点缺失，由此推测， P ₅₃基因的失活可能会带来急性转化。 P ₅₃基因的失活在其他造血器官肿瘤也可看到，并怀疑它与ATL进展及MDS的白血病转化等有关。另外，已知在白血病细胞株的建立上，P ₅₃基因的失活是重要的。

大多数急性早幼粒细胞白血病（APL）产生 PML RARα融合基因。此融合蛋白具有抗凋亡作用，与APL发生有关，将 PML RARα转染至单核细胞白血病株U ₉₃₇能明显抑制细胞毒剂所诱导的凋亡；转染至红白血病株TF-1，也能明显减弱由于去除CM-CSF所致的凋亡，再加入GMCSF则能刺激快速生长，这种APL特有基因可直接或间接影响凋亡的相关基因 P ₅₃、 bcl- 2、 C- myc等，从而抑制凋亡，促进白血病发生。

在慢性髓细胞性白血病，有90%以上的病例发生染色体相互易位t（9；22）（q34；q11）。其结果9号染色体上的 C- abl基因移至22号染色体上的切断点bcr，形成 bcr- abl嵌合体基因， bcr- abl嵌合基因的蛋白产物通过抑制白血病细胞凋亡而延长其生存时间，并非促进细胞增殖。因此白血病细胞凋亡受抑可能是Ph（+）白血病发生机制之一。bcr-abl抗凋亡作用与abl蛋白酪氨酸激酶（PTK）活性有关，abl PTK能活化Ras蛋白，使shc酪氨酸磷酸化，C-myc、mRNA水平增高而起抗凋亡作用。Fas介导的凋亡也受abl调节，将Fas转染至表达bcr-abl的K ₅₆₂细胞，APO-1抗体或Fas 1不能致其凋亡，而下调bcr-abl后则对Fas介导凋亡高度敏感。abl还能抑制浆膜磷脂酰丝氨酸重新分布，阻止酰基鞘氨醇（Ce-ramide）介导的凋亡。

已知自分泌，旁分泌机构产生细胞因子是为白血病细胞增殖的一种类型，即白血病细胞可与自身产生的细胞因子发生反应，或通过与邻近骨髓基质细胞，成纤维细胞、内皮细胞的细胞因子的应答而增殖。

IL-2、IL-3、G-CSF、GM-CSF依赖性的白血病株在不存在细胞因子时可因细胞凋亡而使细胞死亡，在IL-2、IL-3依赖性小鼠骨髓系细胞株，PTK活性可抑制细胞的Bcl-2表达和细胞凋亡。IL-2、IL-3虽然能增加bcl-2 mRNA水平而抑制细胞凋亡，但这种作用会因酪氨酸激酶的阻滞剂而阻断。另外，从B淋巴细胞白血病患者所得的白血病细胞虽然会自然或因氢化可的松而诱导细胞凋亡，但由IL-4可使Bcl-2的表达增加，从而抑制这种细胞凋亡，在骨髓系白血病的细胞株，G-CSF和IL-16可抑制各种抗癌剂诱导的细胞凋亡，这种细胞凋亡的抑制机制，除内在的基因异常外，在细胞因子的外在刺激下也可产生细胞凋亡的抑制。近年来，虽然多使用G-CSF以改善化疗后的骨髓抑制，但在某些情况下，不如用诱导白血病细胞凋亡的抑制方法。

随着对细胞凋亡研究的深入，人们愈来愈认识到它在白血病治疗方面的重大意义，由此产生一种新的治疗方法-诱导凋亡疗法。

目前常用的抗白血病化疗药物均可诱导细胞凋亡，是清除白血病细胞的机制之一。这些化疗药物引起的细胞凋亡，可能通过活化ICE家族，间接使Ca ²⁺依赖性内切酶活性增高而致DNA降解——凋亡。拓扑异构酶与DNA形成断裂复合物，导致DNA损伤，再通过P ₅₃诱导凋亡，但Vp16对缺乏P ₅₃的HL60细胞也可致凋亡，说明也可通过非P ₅₃依赖途径导致凋亡。紫杉醇是微管毒性剂，也可使bcl-2磷酸化而失活，有助于凋亡。自1995年哈医大首先报道三氧化二砷诱导早幼粒细胞白血病凋亡 ^［6-8］以来，三氧化二砷是目前国内外研究凋亡疗法的最热门的药物之一，对其研究从临床到实验室，从宏观到微观进行地较为深入，三氧化二砷对急性早幼粒细胞白血病克隆有杀伤及抑制作用，用于治疗APL疗效明确，完全缓解率（CR）和长期生存率高，不引起出血和骨髓抑制。此药成为比维A酸更优越的治疗APL的物效药物 ^［9］。

随着对细胞凋亡研究的深入，人们对肿瘤，特别是白血病发生已进一步认识到，白血病的发生是由于相关基因的异常致使对某类细胞的生长、发育和死亡调控障碍（恶性变）表现：①异常无限度增殖；②分化、成熟障碍；③凋亡过程的障碍。既往的化学疗法在杀灭白血病细胞，抑制其增殖的同时，也有促进凋亡的作用，尤其在小剂量用药或化疗后遗留作用时。细胞凋亡研究的深入，引导人们思考如何将凋亡理论用于肿瘤或白血病治疗，如何选择药物，设计化疗方案以及何为理想方案或为理想的治疗程序。我们认为理想药物或方案组成具有杀伤并抑制肿瘤或白血病细胞增殖，诱导分化和促进凋亡的作用，三氧化二砷就是治疗APL比较理想的药物，但其杀伤和抑制克隆增殖作用不如其他常用药物。化疗药物很可能加强As ₂O ₃对克隆的抑制作用。对APL治疗，我们认为As ₂O ₃和全反式维A酸（A-TRA）与化疗药物同时或序贯性治疗可能是较理想的方案。APL患者完全缓解率高，长期存活者较多，可能与此有关 ^［9］。

细胞分化与凋亡受不同基因调控，但两者也有一定联系，Calabresse等观察ATRA能诱导APL分化，很少凋亡，但bcl-2显著减少。Bruel等观察ATRA对NB ₄作用而结果与之相似，但对耐药的NB ₄株（NB ₄-R ₁）则见大量细胞凋亡而bal-2高表达，表明NB ₄细胞中分化与bcl-2下调有关。凋亡与bal-2下调无关，另外也说明凋亡与分化不能同时发生。Benito等的结果似与其相反。他们用ATRA、咐醇酯（TPA）诱导HL ₆₀分化过程中出现明显凋亡，同时bcl-2下调。高表达的bcl-2可以抑制HL ₆₀终末分化，本研究揭示HL ₆₀分化与凋亡同时发生，bcl-2是分化途径，也与凋亡相关。

Ehinger等将野生型P ₅₃转染至U ₉₃₇细胞，再经1，25-（OH） ₂D ₃处理，发现维生素D ₃能阻止P ₅₃介导的凋亡而促进分化，揭示P ₅₃蛋白水平的高低可能是决定分化还是凋亡的关键，某些促分化剂如维生素D ₃、TPA可使P ₅₃偏向分化而抑制其致凋亡作用。

GM-CSF、IL ₃、干细胞生长因子（SCF）能抑制凋亡，SCF能抑制P ₅₃介导的凋亡，GM-CSF可使AML细胞bcl-2水平升高，G-CSF虽可下调bcl-2，但可上调A1、MCL-1。因此在选用造血生长因子（HGF）时应慎重。

IFN-α能抑制糖皮质素、放射线诱导的凋亡，保护B-CLL细胞，这些作用可能与其bcl-2上调有关；IFN-γ通过抑制P ₅₃而抑制化疗药物和去除生长因子诱发凋亡。

TNF对急性前B细胞白血病（BCP-ALL）和HL ₆₀、Vs ₃₇有诱导凋亡作用；TGF-β ₁能使一些AML细胞和鼠M ₁细胞株凋亡。

在Scid鼠-人工的T-ALL模型中显示APO-1抗体可诱导白血病细胞凋亡。体外研究显示白血病细胞对APO-1有一定耐药性，但可通过加用蛋白抑制剂逆转，因此可考虑用于自体骨髓移植体外净化；细胞毒性T细胞（CTL）和LAK、NK细胞一样能克服bcl-abl抗凋亡作用而引起凋亡。因此也可以考虑用CTL、LAK、NK细胞做CML的自体骨髓移植。

Keith等（1995）对7例高表达bcl-2AML患者细胞进行体外转染反义bcl-2，可明显减少bcl-2、mRNA，促进细胞凋亡并增加APC-C致凋亡效应。

Smetser等（1995）转染反义bcr-abl后，使Ph ⁺的白血病细胞株BV ₁₇₃凋亡；使CML克隆形成减少；使K ₅₆₂对化疗药物敏感性增加。

转染促凋亡基因bcl-Xs到白血病细胞，可明显增强药物诱导凋亡的作用，而不引起正常骨髓细胞凋亡（Clarke等，1995）；转染野生型P ₅₃，可诱导V ₉₃₇凋亡或有利于分化（E-hinger等，1996）。

近来研究揭示耐药与凋亡相关基因有一定关系，bcl-2表达增高能使白血病细胞抵抗糖皮质激素，Vp16、柔红霉素、米托蒽醌、Ara-c、甲氨蝶呤、长春新碱、阿霉素及维A酸类药物诱导的凋亡。研究表明bcl-2不阻止药物进入细胞、不影响药物对DNA的损伤程度或DNA的修复速率，也未发现其影响细胞周期。如果撤除药物则bcl-2表达细胞快速增殖。因此推测耐药可能与bcl-2的抗氧化剂作用、影响Ca ²⁺的分布及抑制凋亡信号转导途经有关（Reed，1995）。

其他基因也与耐药相关。Reed（1995）研究bcl-X _L高表达可明显减轻Vp16等药物的细胞毒性，还可避免化疗物通过P ₅₃介导的细胞凋亡。 Bcr- abl融合基因也拮抗多种化疗药诱导凋亡作用，这与abl PTK高表达相关，abl PTK能使蛋白激酶C活化，突变型P ₅₃也有助于CML产生耐药，这可能与缺乏正常P ₅₃对DNA损伤产生凋亡反应有关。

IFN-γ及TNF-α可显著上调正常CD ₃₄ ⁺细胞Fas抗原表达并表现出协同效应。在IFN-γ和TNF-α的参与下，CD ₃₄ ⁺CD ₃₈ ⁺、CD ₃₄ ⁺CD ₃₈ ^-和AA患者CD ₃₄ ⁺细胞更新及长期培养后的细胞（LTC-IC），对抗Fas抗原的McAb的造血抑制作用易感性显著增加，琼脂糖凝胶电泳上可见它们作用后，造血祖细胞核呈典型“梯形”图谱，说明它们能诱导CD ₃₄ ⁺细胞凋亡。

Maciejewski等（1994）报道正常人CD ₃₄ ⁺细胞仅8.3%表达Fas抗原，AA的CD ₃₄ ⁺细胞表达Fas抗原高达43%，并对抗Fas抗原McAb的抑制造血作用敏感性增加。AA骨髓半固体培养体系中加入抗Fas抗原的McAb，其CFUGM集落产生率较正常人的降低63%（ P<0.01）。这些研究表明AA CD ₃₄ ⁺细胞体外在IFN-γ及TNF-α刺激后，Fas抗原高表达，通过抗Fas抗原介导的凋亡机制，受到活化的T淋巴毒细胞（CTL）杀伤，提示凋亡在AA造血干细胞衰竭中的重要作用。

在细胞生理学调控中，要清除发育过程中潜在的自身反应性淋巴细胞，细胞凋亡是其基础之一，而要清除完成免疫反应后的过剩细胞，同样需要细胞凋亡。不能消除自身免疫细胞，并使其在发展中增多或在免疫反应中造成体细胞突变，则可发生自身免疫病。目前虽不完全了解自身免疫病直接与程序性细胞凋亡基因调控的相应关系，然而，系统性红斑狼疮（SLE）、风湿性关节炎、银屑病、肾小球肾炎与自身免疫性糖尿病等病人的淋巴细胞，在离体培养及实验动物模型被证实其发生失控性程序性细胞凋亡，这在自身免疫疾病中具有重要地位。

调控淋巴细胞凋亡的关键分子之一是其表面Fas抗原受体，Fas与自身免疫疾病密切相关。Lpr（lymphoproliferation Mutafitn）鼠和Sld（gereral lymphpoproliferation diesnst）鼠由于体内CD ₄ ^-、CD ₈ ^-T细胞Fas缺陷引起，为研究Fas在T细胞发育中的作用，提供了合适的模型。 Lpr基因在19号染色体上与Fas基因相连。Lpr鼠有两种变型：Lpr型 Fas基因中间插入了一个早期转座子（来源反转录病毒）不能编码功能Fas抗原，LprCy型则在核苷酸T ₈₆位点上发生了T→A点突变使胞内区天冬氨酸替代异亮氨酸，致无活性原分子产生，而916鼠则被认为是 Fas配体基因缺陷而不能产生功能分子。系统性红斑狼疮（SLE）病人也存在 Fas缺陷。Chens在分析从SLE病人PBMC得到的Fas-CDNA时发现其核苷酸序列等700～762位缺失，导致整个跨膜区的丢失，由此产生可溶性Fas抗原分子。他还检测了SLE病人的外周血可溶性Fas抗原浓度，发现60%以上浓度高于正常。该分子可中和Fas单抗。将它注入鼠体内，CD ₄ ^-、CD ₈ ^- 、CD ₄ ⁺ 、CD ₈ ⁺ 细胞显著增加而CD ₄ ⁺ 和CD ₈ ⁺ 显著下降。另外，重症肌无力病人胸腺细胞Fas表达也明显下降，说明Fas负责自身反应T细胞的清除。由于它的缺陷，大量自身反应T细胞（CD ₄ ^- 、CD ₈ ^- 、CD ₈ ⁺ ）逃避了胸腺的阴性选择，是自身免疫性疾病发生的重要机制。

成熟B淋巴细胞被激活亦引起 Fas基因表达，激活T细胞上的Fas与激活的自我攻击性B细胞上Fas的结合，亦可能引起细胞自杀，突变B细胞逃逸此程序后，亦可反应性地产生包括自身抗体在内的大量免疫球蛋白。

目前的程序性细胞凋亡的研究，拓宽了自身免疫病的病理基础研究领域。其细胞凋亡的特征性形态表现，Fas系统的调控失灵，或许还涉及某些基因突变，均对自身免疫病机制的了解，启迪了新的思路。未来的深入研究，有可能开拓基因水平的新的治疗途径。

HIV感染者发生艾滋病的原因主要是CD ₄ ⁺T细胞、CD8 ⁺T细胞和神经元的功能障碍和数量骤减，CD ₄ ⁺T细胞减少引起机体免疫功能不全，容易发生各种机会感染，导致病情迅速恶化。目前已经明确，由HIV感染而引起的CD ⁺T ₄淋巴细胞的死亡属于细胞凋亡。

关于艾滋病的研究中，l986年Kstler等报告了在艾滋病患者肠管上皮细胞中高倍镜下可见染色体凝集现象，这是由于细胞凋亡引起的细胞死亡。1991年，Terai等报告由于HIV感染、PHA刺激后的末梢血淋巴细胞和人T细胞株MT-2出现了伴有染色体凝集和DNA片段的死亡，从而认为HIV感染细胞的死亡为细胞凋亡。因为在Terai的实验中所用的细胞中有高浓度的TNF存在，而TNF是已知的能诱导细胞凋亡的坏死因子。因此，HIV感染本身能否诱导细胞凋亡还不能确定。

此后，Laurent、Grawford等报告HIV感染即使在人T细胞株CCRF-CEM，也可由细胞凋亡机制引起细胞死亡。因为CCRF-CEM与MT-2细胞不同，它不产生TNF，因此认为HIV感染可直接诱导细胞凋亡。

Arenose等报告HIV感染者的淋巴细胞一旦受到PMW等活化因子的刺激就会产生细胞凋亡，而健康人末梢血淋巴细胞则不产生这种现象。因此他们认为HIV感染可引起CD ₄ ⁺淋巴细胞活性化，从而导致其凋亡。他们认为细胞凋亡的产生是由以CD ₄ ⁺分子作媒介的HIV感染细胞活性化而引起的，并推测在HIV感染细胞时，HIV以外被糖蛋白SP120与CD ₄ ⁺分子结合，这种结合信号可导致CD ₄ ⁺淋巴细胞活性化，根据以上观点，要引起易感并发生细胞凋亡，就需要有一种新的信号，若无此信号，即使感染HIV，CD ₄ ⁺淋巴细胞也不会死亡。事实上，在离体实验体系中，仅用gp120处理CD ₄ ⁺细胞是不会引起细胞凋亡的，但Banda等人的报告认为，当使其反应-交联就可导致细胞凋亡。此外还有人认为，在HIV与P120中可使神经细胞Ca ²⁺流入增加，并诱导其发生凋亡。据此，Gousoon和Mortasriar等人提出应从细胞凋亡观点重新认识CD ₄ ⁺淋巴细胞的减少。

由于细胞凋亡与诸多领域均有密切关系，其临床意义愈来愈受到人们重视。目前许多人类待解决的疾病均与其密切相关。某些神经退化性疾病如早老性痴呆、Parkihgor病的发生与特定的神经细胞亚群过早、过度发生凋亡（PLD）有关。凋亡的异常还是胚胎发育障碍或畸形的重要原因。可致胎儿流产，器官、组织缺陷及出现多余赘生物等。

As ₂O ₃诱导细胞凋亡作用，首见于血细胞形态学的发现。在发现诱导分化现象不久，张鹏等 ^［6-8］在观察经As ₂O ₃治疗2～3周后的APL患者骨髓和外周血时，发现较多的退变细胞符合凋亡现象。在CR的44例中37例（84.1%）的骨髓APL细胞胞体欠规整，胞膜欠清晰，胞质见空泡，核膜欠清楚，染色质固缩，凝集不均匀或核溶解、空泡变性等。1994年，在体外实验中，施福东 ^［7，8］等观察到As ₂O ₃与HL60、K562和MOLT4细胞等混合培养24小时后，每个细胞系都见到部分细胞体肿大，大小不一，胞体呈空泡变性，随着培养时间的延长，细胞轮廓模糊，一部分细胞碎裂，部分未裂解的细胞内有粗大块状物或颗粒——核碎裂的残骸。Chen等 ^［5］研究发现As ₂O ₃处理的NB ₄细胞，核染色质浓缩，核碎裂并出现凋亡小体；流式细胞仪分析DNA含量分布显示典型的凋亡细胞裂解，DNA含量低于G ₁期细胞——亚G ₁，DNA电泳可见DNA明显降解。几组研究均观察到As ₂O ₃对ATRA耐药的NB ₄亚克隆MR ₂、NB ₄-306、MR ₁、NBR-1的诱导凋亡作用 ^［10］。

关于硫化砷，Bai和Huang研究发现，红雌黄（As ₂S ₂）可诱导NB ₄和HL60细胞系细胞凋亡。Lu等 ^［11］还观察到As ₂S ₄（AS）处理后的NB ₄细胞停滞于G ₂/M期，随后凋亡。AS诱导NB ₄凋亡与CP ₃的激活有关，且该酶的激活不受游离硫基的影响。

关于melarsoprol（一种有机砷），1997年Kong等报道在10 ^-9～10 ^-7M浓度下，能诱导NB ₄细胞和惯性淋巴细胞白血病凋亡时，观察到Bcl-2在转录和翻译水平被下调呈剂量依赖性。

Wang、Zhang等观察到As ₂O ₃和melarsoprol对髓性白血病细胞系NKM-1、HL ₆₀、KG-1、U ₉₃₇和淋巴细胞系肿瘤细胞NOL-3（淋巴瘤细胞系）、Raji、Daudi、Nop-1（骨髓瘤细胞系）、NHL、CLL均有抑制生长和诱导凋亡作用。Zhu等研究了包括来源于急性前B淋巴瘤（BJA B）伴t（14；18）染色体移位的滤泡样B细胞淋巴细胞白血病（Nalm-6）、Burkitt淋巴瘤（Namalua和Raji）、B细胞淋巴瘤（SU-DHL-4）和来自急性T淋巴细胞白血病细胞系（SKW-3）和原代恶性淋巴细胞系（SKW-3）等，显示药理浓度的As ₂O ₃对大多数恶性淋巴细胞具有双重效应——通过延长细胞周期抑制细胞生长和诱导凋亡，而不同细胞系其敏感性不尽相同 ^［12］。李明勋等 ^［13］观察到As ₂O ₃对K562具有显著地抑制生长、杀伤和诱导凋亡作用。

Alemny和Levin报道的As ₂O ₃能抑制4种人巨核细胞白血病细胞系的活力及增殖，诱导其凋亡。Ora等观察到As ₂O ₃通过下调Bcl-2和激活CP-3诱导神经母细胞瘤（NB）的6种不同细胞系细胞凋亡，他们认为可用As ₂O ₃与现行治疗药物联合治疗高危的NB。陈其奎等报道As ₂O ₃能有效抑制体外培养的胰腺癌SW1990细胞系生长并能诱导其细胞周期的阻滞和细胞凋亡。谭立军等、Shen等及颉东旭等均报道As ₂O ₃能诱导食管鳞状上皮癌细胞系EC8721凋亡，还抑制其增殖，As ₂O ₃主要作用在G ₂/M期。As ₂O ₃能诱导人肺腺癌株GLC-82细胞凋亡，高于10μM显现细胞坏死作用。郁宝铭等观察到As ₂O ₃诱导结肠癌Lovo细胞在S期凋亡。Vslu等研究As ₂O ₃可诱导前列腺癌细胞系（DU145和PC-3）、卵巢癌细胞系（MDAH2774）细胞凋亡。

不论我们现在所知多少，体内多种酶的活性可能对抑癌基因与癌基因的功能及其平衡有着重要的影响。某类酶可能在特定的肿瘤发生过程中起着直接或间接的作用，某些酶活性的变化，可能决定着某种肿瘤细胞的生存与死亡。砷化物对APL和其他肿瘤的临床或实验性抗癌效应——诱导细胞凋亡，很可能与As直接干扰了许多酶的活性有关 ^［14］。

As ³⁺能与体内许多含硫基的酶相结合，可直接影响细胞的呼吸、氧化和代谢。Hossain等发现NaAsO ₂诱导胸腺T淋巴细胞凋亡是通过细胞膜到细胞核的信号级反应，这个全部过程均可被二硫基苏糖醇（DTT）所阻断，这证明As ³⁺的作用必须有As与硫基蛋白的结合，才能通过信号转导过程诱导T淋巴细胞凋亡。GSH（谷胱甘肽）是细胞内抗氧化物，As ³⁺与GSH的硫基结合，抑制了GSH清除自由基——抗氧化功能及重要的解毒功能。砷化物干扰硫基酶的活性，引起细胞呼吸、氧化、氧化磷酸化过程和能量代谢障碍以及活性氧类等对细胞多方位的损害，可能是导致肿瘤细胞凋亡、杀灭抑制增殖的基本机制。

线粒体是对砷最敏感的细胞系，线粒体功能障碍，可能是细胞启动凋亡的重要因素之一。线粒体膜通透性转运孔（MPT）主管膜内外交通。MPT的重要成分是邻近含硫基的腺嘌呤核苷转位蛋白（ANT）。As ³⁺与这些硫基结合形成二硫键则MPT开放。当As ³⁺导致细胞能量代谢障碍及活性氧类（ROS）等氧化物损伤线粒体膜使MPT通透性增强，细胞色素C和其他凋亡诱导因子（AIF）的产生和释放到胞质中，继而出现链式凋亡反应 ^［15］。

半脱氨酸酶（caspase，CP）家族：CP具有诱导凋亡的活性。Applegate等研究表明As ₂O ₃诱导NB ₄凋亡时，CP ₃被激活，在APL和两个多发性骨髓瘤细胞系中As ₂O ₃能活化CP ₃。Akao等 ^［15］观察到砷剂诱导KOLL ₄₄和LYH ₇的凋亡是与CP有关；应用CP ₈抑制物ACIETD-CHO进行凋亡抑制分析观察到NB4细胞凋亡时伴有CP ₈活化。这些研究表明，CP级链式的活化可能是As化物诱导凋亡的重要信号通路。

酪氨酸激酶（PTK）：PTK在细胞增殖和分化的信号转导中起重要的作用。肖冬梅等在研究As ₂O ₃诱导K ₅₆₂凋亡中观察到细胞的PTK活性和BCR/ABL及ABL特异蛋白的PTK活性均降低，随之细胞内某些蛋白酪氨酸磷酸化过程也减少，提示As ₂O ₃通过降低PTK活性来阻断BCL/ABL的抗凋亡信号的传导从而诱导K ₅₆₂细胞凋亡。

丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）：MAPK信号通路具有调解细胞分裂和凋亡作用。当细胞经过As ₂O ₃处理，则MAPK信号转导，同时与应激相关的C-Jun氨基末端激酶、应激激化蛋白激酶以及P ₃₈/MPK ₂被激活，表明As ₂O ₃诱导凋亡可能与MAPK信号通路有关。

砷化物和其他抗肿瘤的细胞毒类药物，可能通过酶这个中心环节，改变和影响某种或某些酶的活性，继而引起一系列生物学，包括细胞学、分子学或基因学的抗癌效应。