新发传染病具有突发性、不确定性、传播快、危害大的特点，严重威胁社会安定甚至国家安全，是我国乃至全球传染病预防控制的难点，也是公共卫生安全面临的巨大挑战。新发传染病疫情暴发时，实验室在第一时间鉴定和诊断病原体，对于病人的及时救治、有效防控措施的制定以及疫苗和药物的研发等都是至关重要的。最近几十年中，频繁出现的新发传染病疫情，迫使病原体的实验室诊断技术不断发展和进步。特别是目前全新分子生物学技术在此领域的应用，使新发传染病病原诊断的周期不断缩短，灵敏度和准确性也不断提高。

以往新发传染病病原的常用诊断技术，包括20世纪最早用于病毒鉴定的组织细胞培养技术、基于抗原抗体反应的酶联免疫吸附实验 （ELISA）方法、结合了细胞培养和抗原抗体反应的免疫荧光技术、基于光学显微镜和电子显微镜的病原体形态观察技术等。病毒的组织细胞分离培养尽管仍是病毒鉴定的金标准，但往往需要较长的实验周期，而且组织细胞发生病变后仍需要采用其他方法对分离培养的病原体做进一步的鉴定；基于抗原抗体反应的ELISA方法用于检测病原体的抗原或抗体，虽然检测所需时间较短，但存在灵敏度低、交叉反应以及 “窗口期”的问题；基于光镜和电镜的技术，只能根据病原体形态进行初步的类别判断，且镜检的敏感性较差，往往对样本中病原体含量有相当的要求。然而，无论是临床诊断救治还是公共卫生疫情控制，都需要快速、灵敏和精准的病原检测技术手段，在尽可能短的时间内明确感染的病原。因此，在最近的二十多年间，基于分子生物学的分子诊断技术由于其快速、灵敏和特异等优点，在新发传染病病原体检测中被广泛应用。分子生物学方法检测的是病原体的遗传物质，即基因。利用这一技术，不仅能在病人标本中直接检测到微量的病原体基因，还能对病原体进行精确的分型，了解其耐药变异、基因重组重配、毒力相关因子等情况，为精准治疗和公共卫生防控工作提供更为丰富的具有参考价值的数据。

分子诊断技术最初被应用于临床病原检测是始于20世纪90年代，而核酸分子杂交方法是分子诊断技术中最先被应用的方法。分子杂交方法是利用标记的核酸探针检测分离培养物或临床标本中的病原体核酸，因其操作复杂、耗时耗力等原因，虽然在检测敏感性上有了一定提升，但不适合在临床上大规模应用。很快，一种叫聚合酶链式反应 （PCR）的技术取代了分子杂交方法，因其在检测速度、灵敏度和特异性方面相对于其他方法的突出优势，被临床诊断实验广泛使用，包括用于乙肝病毒核酸 （HBV DNA）的检测；在此基础上发展出的逆转录PCR（RT-PCR）方法被用于丙型肝炎病毒核酸 （HCV RNA）和艾滋病毒核酸 （HIV RNA）等的检测。几年后，实时荧光定量PCR技术的出现使分子诊断从定性诊断跨越到了病毒核酸定量检测的阶段。标本中病毒核酸基因拷贝数的检测为临床提供了病原复制水平和药物治疗有效性等多方面的信息。

然而，导致相似临床症状的病原体往往不是单个的，例如导致发热伴呼吸道感染症状的常见病原体至少包括了流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒等十多种病原体，而寨卡病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒等黄病毒家族成员导致的发热、出疹和关节痛等临床症状极为相似且流行区重叠。因此，传统的单通道PCR方法仍然无法满足临床一线和公共卫生防控部门对多种病原体快速筛查和鉴别诊断的需求。为此，一批高通量的检测方法应运而生。以基因芯片技术 （核酸杂交）、多重PCR技术 （核酸扩增）和多重实时荧光PCR技术 （核酸扩增和杂交）、液态芯片技术 （核酸扩增和核酸杂交）、质谱联用技术（核酸扩增和分子量分析）以及深度测序技术 （核酸扩增和序列分析）为代表的多个病原体核酸检测技术为及时快速地筛查鉴定病原体提供了有效的手段。其中，多重PCR（包括多重实时荧光PCR）、质谱联用技术和液态芯片技术等一次可同时检测十多种甚至几十种病原，适用于对标本的初步筛查；而基因芯片、深度测序技术等可对未知或新型病原进行鉴定。以下就目前常用的和最新的新发病原分子诊断技术进行逐一介绍，以便了解其基本原理、特点和应用范围。

检测不同的病原体核酸。PCR是一种体外DNA扩增技术，但其过程类似于DNA的天然复制过程，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，通过DNA聚合酶的酶促反应合成新的DNA链，其扩增的特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经 “高温变性—低温退火—引物延伸”3步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得大量的特定基因片段，后续通过各种其他技术对扩增所得产物进行检测。为扩增病原体的核酸，需针对各种病原体核酸序列设计特异性扩增的引物。然而，不同的病原体的基因组组成和突变率不同，在引物设计和探针选择方面也大不相同，需要利用已知的病原体基因序列信息进行多序列的比对（Alignment），找出基因组中合适的区域段作为靶点，设计多套相应的引物，采用计算机专用软件进行优化。为了提高核酸扩增的特异性，通常在基因库GenBank中搜索确认候选引物是否会与人类基因序列或其他病原体序列具有一定的同源性而导致非特异性扩增。

近年来，导致新发传染病的病原体往往是RNA病毒。由于RNA病毒的多聚酶在子代病毒复制过程中的校正功能较弱，容易发生基因突变或基因片段重组重配。面对具有高突变率的RNA病毒，引物选择和数据分析较为复杂。随着RNA病毒变异的不断积累，扩增的靶序列中可能会出现位点的退化，从而需要相应地更新检测的引物。如果因病原体发生重组或重配而导致靶序列的较大变化，则需要直接更换检测的引物。为了克服上述困难，提高病原检出率，研究人员发展了基于保守序列的PCR扩增 （consensus PCR）。首先，通过比对病原所属家族的所有成员的基因序列，找到相对保守的序列区域设计通用引物，做初步的筛查检测。对于阳性标本，进一步用目标病原体特异性的序列进行PCR扩增。如果疑似为这一家族中的新成员，则用consensus PCR扩增所获基因片段，通过直接测序得到新病原的基因片段序列。典型的例子是小核糖核酸病毒 （picornavirus）和冠状病毒等。小核糖核酸病毒科包括29个属50个种的一大类病毒，不同种的病毒分型更复杂，如鼻病毒和柯萨奇病毒，如何将这一类病毒 “一网打尽”？研究人员发现不同种属的小核糖核酸病毒在其基因组的5'非编码区高度保守，因此在这一区域设计通用引物扩增靶基因，然后根据PCR产物测序结果可以对小核糖核酸病毒进行分型。在SARS疫情出现时，研究人员从病例呼吸道标本中分离培养出一种未知病毒，由于电镜下发现此病毒具有冠状病毒特有的花冠样形态结构，因此研究人员使用了冠状病毒家族的保守序列引物，直接获得405核苷酸碱基长度的PCR产物，通过测序确定为是冠状病毒家族中的一个独特的新成员，后命名为SARS冠状病毒。

新发传染病在未明确病原前，往往需要排查常见的已知病原。单个PCR反应检测一种病原的方式，显然耗时耗力，因此采用在一个PCR反应体系中加入多种病原检测引物的方式，且不同靶标基因的扩增产物大小并不相同，这样可以通过电泳区分不同病原体的基因扩增产物从而达到在一个反应管中检测多种病原体的目的。为提高检测灵敏度，多重RT-PCR检测通常使用两轮PCR的扩增 （即巢式或半巢式PCR的方式）。然而，多重PCR扩增与电泳联用的方法需要克服不同引物对之间的相互干扰，平衡各个引物对之间的扩增效率。由于多个靶标基因扩增PCR产物的大小比较接近，给电泳结果判断增加了难度。于是，有人使用毛细管电泳的方法提高电泳的分辨率，解决了这一问题，但在一定程度上增加了检测的成本。

实时荧光PCR检测技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，因PCR产物信号的检出模式从传统的电泳模式改进为荧光信号读取模式，因此其具备更为准确、快速和灵敏等优势。近年来，该技术在新发突发传染病 （埃博拉病毒、MERS冠状病毒病毒、寨卡病毒、甲型H7N9流感等）和常见病原体的检测和诊断中均发挥了重要作用。荧光PCR的化学原理可分为3个基本类型：DNA结合染料法、探针法和猝灭染料引物法。目前，在传染病的分子诊断中一般建议采用探针法。探针法依赖荧光共振能量迁移实现检测，包括TaqMan探针、分子信标、蝎型探针和复合探针等。由于设计的探针仅与特异性扩增产物结合，因此检测的特异性较强。其中，复合探针技术是国内唯一具有自主知识产权的实时荧光PCR技术，具有噪声信号低、灵敏度高等优点，目前基于该技术已开发出了系列的传染病诊断试剂。多重实时荧光RTPCR技术 （multiplex real-time reverse transcription PCR）是在多重RT-PCR技术的基础上引入荧光探针。然而，多个靶点的检测需要不同标记的多个荧光探针，但是荧光探针的数量受到荧光PCR仪器检测通道的限制 （普通荧光PCR仪检测通道为2个，多的也只能达到6个），因而一个多重实时荧光RT-PCR反应体系只能同时检测几种病原。

核酸等温扩增技术是近年来发展迅速的另一种体外核酸扩增技术，与PCR扩增不同的是其扩增反应始终在一个温度下进行，不需要在不同温度下完成变性、退火和延伸等过程，且对温度的控制也无需那么精密。因该技术具有操作简便、反应快速、检测灵敏度较高以及设备要求低等特点，主要被应用于临床诊断和新发突发传染病疫区现场的快速诊断 （POCT）。目前已有的等温扩增技术包括滚环等温扩增 （RCA）、环介导等温扩增 （LAMP）、链替代等温扩增 （SDA）、核酸序列依赖性扩增法 （NASBA）、依赖解旋酶等温扩增 （HDA）、单引物等温扩增（SPIA）和交叉引物扩增技术 （CPA）等。LAMP（loop-mediated isothermal amplification）是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件 （63℃左右）保温30～60分钟，即可完成核酸扩增反应。目前该技术已成功应用于手足口病原体EV71病毒、结核分枝杆菌、登革热病毒、黄热病毒等的检测。NASBA（nucleic acid sequence based amplification） 是等温扩增RNA的新技术。反应在42℃进行，可在2小时内将RNA模板扩增约10 ⁹倍。整个反应过程包括：引物I与模板RNA退火后在AMV反转录酶的作用下合成cDNA，形成RNA：cDNA杂合体，其中的RNA链随即被RNaseH降解；此时，引物Ⅱ与cDNA退火，在反转录酶作用下合成第2条DNA互补链；双链DNA可在T7RNA聚合酶的作用下，经引物5'端带有的启动子序列而转录出多条RNA；这些RNA又可作为模板在反转录酶的作用下反转录成cDNA，从而实现对模板的大量扩增。这一技术已成熟地用于HIV和HCV等多种RNA病毒的检测。

质谱技术 （MS）是一种快速敏感的检测分子量的方法。随着基质辅助激光解吸电离 （MALDI）和电喷射离子化 （ESI）等技术的进步，MS逐渐成为生物医学领域中一个重要的检测工具。多重PCR与其联用能够进行高通量的病原体检测。质谱标签PCR技术与常规的多重PCR技术不同的是，针对不同病原的PCR扩增引物被标记了不同的分子量标签。PCR扩增产物因引物而带有分子量标签，通过质谱分析产物携带的分子量标签就能判断病原体种类。目前开发的用于质谱检测的分子量标签有几十种，因此mass-tag PCR检测通量远高于单纯的多重PCR或多重荧光PCR。美国哥伦比亚大学Lipkin教授研究组已经建立了基于此技术上的5种检测模块，包括呼吸道病原体检测模块、流感病毒分型模块、出血热病原检测模块、出疹病毒检测模块和脑炎病原体检测模块等，其中呼吸道病原体检测模块检测包含19个病毒和3种细菌，出血热病原检测模块检测包含10种出血热病毒。但这项技术不仅需要PCR仪，还需要昂贵的质谱仪，增加了检测的成本和时间。这些因素影响了其推广应用。

　“液相悬浮芯片”技术是Luminex开发的一项生物芯片技术，其整合了液相芯片检测平台和多重PCR技术。将针对不同病原体的基因探针以共价交联的方式结合到特定的编码微球上，这些不同的微球一起与多重PCR扩增产物在一个反应体系内共孵育，因PCR产物与微球上的相应探针杂交而被捕获到微球上。通过仪器同时识别编码微球所带的特定荧光以及微球上PCR产物携带的荧光，从而确定多重PCR扩增的结果。由于仪器可识别的编码微球有几十种，因此其检测通量也高于单纯的多重PCR电泳检测或多重荧光PCR技术。目前Luminex公司已研发了呼吸道病毒筛查试剂盒 （xTAG respiratory viral panel，RVP）、肠道病原检测试剂盒 （xTAG gastrointestinal pathogen panel，GPP）和单纯疱疹病毒分型检测试剂盒（MultiCode ^®-RTx HSV 1＆2 Kit）以及22种蚊媒病毒的检测试剂盒获得了美国FDA批准上市。最近，Perkin Elmer公司组合多重PCR技术与荧光条形码技术形成另一种液相芯片检测系统。该系统由Pre-NAT全自动核酸检测反应体系构建系统和ABC 3000液相芯片杂交检测仪构成，其特点是在检测引物中引入微磁条码，每种病原体的检测引物都有对应的微磁条码编号，通过仪器读取条码的信息就能判定检测结果。目前Perkin Elmer公司研发了呼吸道病原体检测试剂盒 （PCR液相芯片法）能够一次检测22种常见的呼吸道病毒、支原体和衣原体。

微流控 （microfluidics）指的是使用微管道 （尺寸为数十到数百微米）处理或操纵微小流体 （体积为纳升到阿升）的系统所涉及的科学和技术，是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科。因为具有微型化、集成化等特征，微流控装置通常被称为微流控芯片，也被称为芯片实验室（lab on a chip）和微全分析系统 （micro-total analytical system）。微流控的早期概念可以追溯到19世纪70年代采用光刻技术在硅片上制作的气相色谱仪，而后又发展为微流控毛细管电泳仪和微反应器等。微流控的重要特征之一是微尺度环境下具有独特的流体性质，如层流和液滴等。借助这些独特的流体现象，微流控可以实现一系列常规方法所难以完成的微加工和微操作。目前，微流控被认为在生物医学研究中具有巨大的发展潜力和广泛的应用前景。最近BioFire公司研发的FilmArray技术是利用生物膜微流控技术，该技术将样本的抽提、核酸的扩增和结果读取等步骤整合在一个封闭系统中，通过小仓之间的通道利用微流控技术完成小仓内液体的单向流动。其PCR过程大致如下：将抽提小仓中的核酸通过微流控技术加入含有引物、Tag酶、缓冲液的混合液中，然后让PCR反应混合物在微流控下重复通过三个恒温区域 （变性区、退火区和扩增区），从而实现DNA体外复制的全过程。这种技术的优势在于反应液体积小、所需检测时间短 （在1个小时内完成）、检测靶点多、操作简便等，其缺点是成本高、每次只能检测一份标本。未来随着微流控芯片成本的降低，此技术有望在临床大量推广应用。

高通量测序技术 （HTS）的发展使病毒学领域发生了革命性变化，它能够更简单更全面检测病毒全基因组，识别和分类新的或已知病毒，准确描述病毒数量，因而广泛应用于分子流行病学、病毒多样性和进化、传播以及发病机制的研究。新病原体发现方面的成功应用案例，包括发现导致三名妇女器官移植后死于脑炎的沙粒病毒、导致溶血性尿毒综合征的大肠杆菌O104：74、非洲中部急性出血热相关的新型丝状病毒以及中枢神经系统感染患者中检测出的新型环状病毒。

目前，HTS成熟平台主要有三家，包括Roche公司的454GSFLX/GSJunior平台、Illumina公司的HiSeq2000/Miseq平台和Thermo Fisher公司的Ion Torrent PGM平台。它们采用不同的文库制备和测序专利技术，各有所长 （表1-2-1）。对于病原体的发现，一个HTS平台最重要技术指标是：①模板DNA最低起始量；②测序时间和成本；③测序通量；④测序读长。临床样品 （例如组织、粪便和环境样品）中宿主基因片段或环境微生物基因片段的含量很高，而病原体的核酸则相对微量。微生物核酸分离通常需要其他富集技术，因此平台要求的模板最低起始量很重要。文库制备和测序所需的时间和费用也是疫情应答中至关重要的因素。疫情暴发时，病原体的发现需要在最短的时间内完成，通常要求在数天内获得结果。测序读长和数据通量往往会影响测序数据分析的准确度。

GS FLX及GS Junior系统——454焦磷酸测序是第一个被广泛用于病原体发现的高通量测序平台。从样品中提取的核酸 （DNA或cDNA）与带生物素修饰的DNA接头连接，然后结合到表面包被链霉素亲和素的磁珠上，DNA通过使用与连接接头序列互补的引物在油乳液滴中进行PCR扩增 （油包水PCR）。反应产物经纯化富集后结合到微珠转上，被转移到微滴定板中进行测序反应。测序反应中释放焦磷酸分子，催化底物产生发光信号，被CCD摄像机拍摄到。三家测序平台中，454GS平台提供了最长读长 （最大700个碱基），在发现病原方面具有一定的优势，但其相对低的通量使获得病毒或细菌完整基因组序列变得困难，特别是在宿主基因组或环境微生物的序列占了相当比例的情况下。

Illumina高通量测序技术平台目前有两个较为成熟的子平台，其中HiSeq2000因其超高通量而可以同时处理多个样本，2011年发布的MiSeq是一个更快的低通量台式测序仪。Illumina平台使用合成测序技术，标本中的核酸片段被剪切后与接头片段连接。在一个丙烯酰胺包被的玻璃流动池上，通过bridge amplification扩增形成DNA片段克隆集落，测序信号也用CCD相机来捕捉。Illumina平台是现在被应用最广泛的系统，每运行一次读取长度为150左右，并产生600Gb（HiSeq）或者3Gb（MiSeq）的数据。从测序时间上看，MiSeq的测序时间大约27小时，HiSeq为11天，而GSFLX只需要8小时。另外，由于读取的序列长度较短，若要用Illumina平台探索新发病原体，无疑是一个挑战。

Ion Torrent PGM是一种相对较新的平台，像GS FLX一样，利用油包水PCR扩增，但不同的是，PGM系统检测碱基参入时因氢离子释放而造成的pH值变化，并非通过相机扫描读取荧光信号。因此，与其他平台相比，PGM具有运行速度更快 （运行时间约为3小时）且成本更低的优势。依据它所使用的芯片，PGM的通量适中 （20Mb～1Gb的数据），读取长度最大达到200个碱基。最近，这一平台还在不断改进技术，在通量和读长方面有新的提升。尽管HTS获取数据速度快，但是存在测序错误，需要后期用其他实验方法纠正。举例来说，2011年夏天德国暴发了产志贺毒素的大肠杆菌感染，感染者约4000人并将近50例死亡。华大基因组研究院 （BGI）在收到了第一份样本的三天内，使用Ion Torrent PGM平台迅速地获得了初发菌毒株的基因组序列，仅仅24小时后就完成了全基因组装配和注释。由于PGM存在homo-polymer测序错误，BGI之后又采用Illumina HiSeq检测同一份样本，不断修改完善之前结果，并且连续收集了两周样本，得出了一份高质量的数据集合。而1997年获得的第一个完整大肠杆菌序列需要十年工作，相比之下，这份成果的重要性显得相当惊人。

相较于商业化测序服务公司配备大型HTS平台，独立临床病原体分子诊断实验室或监测网络实验室，多选择小型HTS平台包括Miseq和Ion Torrent PGM，直接从单个临床标本中获得病原体全基因组序列。中国医学科学研究院病原所采用H7N9病毒和H10N8病毒感染病人的临床呼吸道标本，平行比较了这两种平台测序表现，发现两者在测序速度、基因组覆盖度和测序深度等指标上非常接近，但是Miseq的测序错误比Ion torrent略低。

将来，HTS测序平台将继续向更廉价更简单更便携发展，例如新出现的单分子DNA测序仪，利用纳米孔技术，实现更低成本获得更长读取长度，而且不需要大量样品。这些新技术不仅可以快速诊断微生物，而且可以实现对临床及远程微生物监控，进一步缩短从发现疾病暴发到行动响应的时间。然而，值得注意的是，HTS测序产生的海量序列信息，无法再使用Sanger测序时代的序列分析方式，因此，发展实验室技术人员可用的生物信息学分析工具是面临的一个重要任务。

尽管高灵敏度的检测方法可以帮助发现标本中的微生物核酸，但如何确认被检测到的微生物是导致疾病或疫情暴发的病原体，始终是病原体鉴定中的核心问题。新病原体与导致疾病之间因果关系的论证需要遵从科赫 （Koch）法则，包括：

1.相同微生物出现在每一病例中，且在健康者体内不存在。

2.微生物可以从宿主分离并在培养基中得到纯培养 （pure culture）。

3.这种微生物的纯培养物接种健康而敏感宿主，同样疾病会重复发生。

4.从发病的试验宿主中能再度分离培养出该微生物。

病原体的分离培养在因果关系论证中作为金标准。

然而，不是所有的病原体都能被培养，且存在无症状携带者，因此科赫法则的适用性受到限制。随着分子技术和免疫检测技术的进展，斯坦福大学的学者等提出基因组时代的科赫法则，包括：

1.属于假定病原体的核酸序列应该出现在特定传染病的大多数病例中。在已知的患病器官或明显的解剖学部位，应能发现该病原体核酸，而在与相应疾病无关的器官中则不会发现。

2.未患病的宿主或组织中，该病原体核酸序列的拷贝数应当较少或完全检测不到。

3.随着疾病缓解，病原体核酸序列的拷贝数应减少或检测不到。如果临床上有复发，则相反。

4.检测到该病原体序列预示疾病将发生，或序列拷贝数与疾病的严重程度相关，则该病原体与疾病极可能构成因果关系。

5.从现有序列推断出的微生物特性应符合该生物类群的已知生物学特性。

6.可用原位杂交来显示发生了组织病理变化的特定区域，以证明微生物的存在，或显示微生物应该存在的区域。

7.这些以序列分析为基础获得的上述证据可重复。

由于先进的高通量测序技术产生的巨大数据量，使得严格遵循因果关系的指南更为重要。像过去一样，科赫假说的现代修订主要集中在利用最现代的分子技术生成的数据。“宏基因组学科赫假说”侧重于使用特异性的分子标志物 （单个序列，重组的重叠群，基因或者染色体组），比较病例与健康对照的微生物宏基因组。在假设微生物可以平等地感染病人和健康人的前提下，病例与对照的差异可以特异性的区分致病和非致病微生物。或者，可以从整体的趋势上去寻求因果关系，基于数据去推导微生物与疾病发生的关联强度。包括微生物的载量、微生物在感染组织中的示踪、抗体水平和生物学特性等。

新发传染病病原的及时鉴定对于临床救治和传染病疫情控制至关重要，新的快速、高通量、高敏感性和高特异性的检测鉴定技术正在不断地被研发和应用。分子生物学与其他学科的交叉技术取得了突出的成果，除了上述介绍的几种成熟的检测新技术外，正在研发和验证之中的还包括微流控技术、纳米金颗粒技术、流式细胞技术与现有的核酸诊断技术的联用等。随着这些技术的不断成熟、标准化和低成本化，有望在临床诊断和疫情防控中被大规模应用。

[1]Ksiazek TG，Erdman D，Goldsmith CS，et al.A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome.N Engl JMed， 2003， 348 （20）： 1953-1966.

[2]Curtis KA，Rudolph DL，Owen SM.Sequence-specific detection method for reverse transcription，loop-mediated isothermal amplification of HIV-1.JMed Virol， 2009， 81 （6）： 966-972.

[3]Firth C，Lipkin WI.The genomics of emerging pathogens.Annu Rev Genomics Hum Genet， 2013， 14：281-300.

[4]Quiñones-Mateu ME，Avila S，Reyes-Teran G，etal.Deep sequencing：becoming a critical tool in clinical virology.JClin Virol， 2014， 61 （1）： 9-19.

[5]Rohde H，Qin J，Cui Y，et al.E.coli O104：H4 Genome Analysis Crowd-Sourcing Consortium.Opensource genomic analysis of Shiga-toxin-producing E.coli O104：H4.N Engl JMed， 2011， 365 （8）：718-724.

[6]Ren X，Hu Y，Yang F，et al.Clinical utility comparison of two benchtop deep sequencing instruments for rapid diagnosis of new ly emergent influenza infections.Clin Microbiol Infect， 2015， 21 （3）：290.e1-4.