7 免疫及炎症反应在深静脉血栓形成中的作用和治疗新思路
静脉血栓栓塞（vein thrombosis embolism，VTE）是继心肌梗死和脑卒中后流行病学上最常见的血管疾病的病理学原因，也成为世界范围内的一个主要公共卫生问题。VTE会引起复发性静脉血栓栓塞、慢性血栓栓塞性肺动脉高压和血栓后综合征等重大的长期并发症，在美国每年大约有90万因此致病，其中约30万人死亡。VTE包括深静脉血栓（deep vein thrombosis，DVT）和肺栓塞（pulmonary embolism，PE）。虽然DVT通常发生在小腿和大腿的深静脉，但也可能发生在上肢深静脉、内脏静脉，甚至腔静脉，不稳定的血栓可能脱落随循环进入肺部，阻塞肺循环，严重时合并有肺动脉高压的形成。肺动脉高压是继心肌梗死和卒中后心血管死亡的第三大原因，也是住院患者可以预防的致死因素。虽然DVT一直被认为是继发于凝血功能紊乱，但最近一些证据表明，免疫细胞和炎症过程参与深静脉血栓的形成。本文将对免疫细胞和炎症在DVT形成中的作用进行探讨。
一、凝血酶促反应
血液凝固主要基于纤维蛋白，其实质是由凝血酶介导将血浆中的可溶性纤维蛋白原转变成不可溶性纤维蛋白的过程。纤维蛋白交织成网，把血细胞及血液其他成分网罗在内，从而形成凝血块。凝血酶是在FⅩa因子介导凝血酶原过程中生成，外源性凝血途径和内源性凝血途径都可以激活FⅩ，其中外源性凝血途径是由组织因子（tissue factor，TF）启动，它因血管受损而暴露，直接与FⅦa相结合而形成FⅦa-组织因子复合物，激活FⅩ生成FⅩa；内源性途径通常因FⅫ与带负电荷的异物表面接触，并激活FⅫa，FⅫa主要功能是激活FⅪ生成FⅪa，FⅪa与Ca2+激活 FⅨ，FⅨa与 Ca2+、FⅧa（被凝血酶激活）、PF3共同形成复合物使 FⅩ激活成 FⅩa。FⅩa与 PF3、Ca2+、FⅤa组成复合物（凝血酶原酶），它将凝血酶原激活为凝血酶（FⅡa）。凝血酶除介导纤维蛋白形成外，还具有多种功能，包括血小板活化和聚集、促炎作用以及通过激活凝血因子FⅪ及其辅助因子FⅤ和FⅩⅢ，由此来放大凝血过程。
目前对DVT的预防模式主要集中在对凝血系统的干预，如针对凝血酶（达比加群酯）、FⅩa（利伐沙班）及维生素K依赖性因子（华法林）的使用（图1）。
由于正常止血机制和病理血栓形成机制存在实质性重叠，因此因出血风险增加会使得抗凝药的治疗窗口缩小。因此，寻找预防DVT更为安全的替代疗法，对该领域的进一步研究可能提供重要的新的治疗选择。Kattula S等发现靶向作用于凝血因子ⅩⅢ可以阻止血栓形成过程中红细胞的滞留从而具有抗凝的潜能，其只对FⅩⅢ进行抑制不会影响机体凝血。尽管其对人体的作用需进一步验证，但这可能是抗深静脉血栓较为有前景的治疗方法。当出现深静脉血栓时，即使在成功治疗的前提下（导管引导下溶栓治疗）也不能排除所有DVT并发症，如复发、肺动脉高压、血栓后综合征等。因此，如今研究的目的主要集中在探索一种能从根本上高效预防DVT而又不会有出血风险的新方法，而重新考虑DVT是免疫和炎症相关的结果而不仅仅是依赖凝血功能的异常为我们提供了思路。
二、DVT形成的机制
血栓形成是通过在血管内皮处产生凝血酶、沉淀纤维蛋白和血小板的过程，它是防止机体血液流失重要的保护性反应。新的研究强调了免疫、炎症与血栓的关系。在DVT形成的病理生理学方面，免疫系统正在成为一个关键参与者，有可能开启新的预防DVT的方法。DVT的形成涉及一系列复杂的级联反应，可以将其分为三个连续且重叠的阶段：①血流异常和缺氧；②激活内皮细胞；③血细胞的堆积叠加（recruitment）激活凝血系统，最终导致血栓形成。图2概述了这些步骤以及免疫细胞的参与。
DVT形成于静脉的瓣膜区。从心室到静脉血压逐渐降低，心脏泵血功能可能无法将足够的血液泵入静脉，因此，辅助肌肉泵的正常功能对维持人体正常血流尤为重要。当肢体肌肉不能规律性适当收缩时，静脉血流速度就会降低直至出现血液瘀滞。因此，在排除癌症或创伤等明确的致血栓风险后，静脉内血流淤滞是原发性血栓的主要原因之一。长期固定的体位可导致血流淤滞，如术后制动、长期卧床及长途飞行。对小儿患者来说，超过72小时的制动被认为是导致DVT的主要原因之一，且住院时间每延长一天，风险就增加3%。随着年龄增加，静脉血流淤滞风险也增高。需注意的是，血流淤滞需要有额外的因素和（或）时间异常延长的条件下才会导致DVT，如正常的睡眠则不会导致DVT的形成。
静脉内的血液是静脉血管壁氧的唯一来源，因此，供血不足会导致局部静脉缺氧。最近的研究表明全身缺氧会导致DVT形成。低氧可激活静脉管壁的各种细胞如肥大细胞（mast cells，MCs）和内皮细胞，导致黏附受体（细胞间黏附分子1，ICAM-1）表达和Weibel-Palade小体释放（weibel-Palade body，WPB，内皮细胞中的储存颗粒），WPB含有不同的蛋白质，这些蛋白质在止血、炎症反应及血管生成中起着重要的作用，ICAM-1表达和WPB释放是白细胞和血小板堆积叠加的先决条件。血流淤滞引起免疫反应的现象早在50余年前就得到了证实[7]，这些免疫细胞通过各种途径导致血栓的形成。
缺氧可导致机体活性氧（ROS）的合成，ROS激活内皮细胞，引起黏附受体的表达和聚集以及白细胞的外渗[8]。氧化应激尤其是ROS损害内皮细胞可激活补体系统，间接激活内皮细胞。内皮细胞活化后分泌释放WPBs，在此过程中，WPBs与细胞膜融合释放其结合产物并表达血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）和P-选择素等，使相关细胞聚集。在对内皮细胞活化小鼠模型的实验中发现，循环系统和静脉壁上P-选择素的升高均与DVT高发生率有关。从机制上来说，WPBs释放的高分子量多聚体VWF为激活补体提供了支撑。补体成分直接与VWF相结合进而通过旁路替代途径被激活。因此，除了缺氧和ROS可以直接激活内皮细胞外，补体系统可能是血流淤滞与内皮激活之间的外在连接代表。
补体系统激活产物沉积在血管壁上会导致炎症的进展。现已知炎症反应会上调C反应蛋白的表达并调节血小板功能，更重要的是，它可影响外源性凝血途径反应和纤溶系统，增强体内对血管损伤的血栓反应。有证据表明，补体系统可能是炎症和血栓之间的联系，揭示了补体蛋白和血小板之间的特定相互作用。补体系统能诱导血小板活化和聚集，同时，血小板可以通过P-选择素激活补体系统[12]。此外，活化的内皮细胞可以加强凝血功能和抑制抗凝作用，进一步导致了血栓的形成。
低氧可以激活肥大细胞（MCs），其具体机制目前尚且不明，但是氧化应激和ROS在此过程中扮演了重要的角色。ROS与MCs活化相互影响，一方面抑制MCs的激活可以减少ROS的生成，另一方面抗氧化剂可以防止MCs细胞脱颗粒。MCs是先天免疫的一部分，主要存在于组织及血管附近，其含有丰富促炎介质颗粒（如TNF-α、组胺）以及抗血栓因子（组织纤溶酶原激活物、普通肝素）。组胺可以诱导WPBs释放VWF和P-选择素，增强E-选择素和ICAM-1的表达以及介导血管壁细胞的堆积。此外，在不同的细胞类型中，组胺可以刺激凝血关键启动因子TF的表达。在对静脉狭窄致DVT小鼠模型研究中发现，MCs缺陷小鼠完全不会形成DVT，但移植体外分化MCs的MCs缺陷小鼠体内可以形成血栓，这说明MCs内促炎介质颗粒的活性大于抗血栓因子活性，MCs的缺乏可能有预防血栓形成的作用。
静脉血流淤滞会引起白细胞迅速堆积。在上腔静脉狭窄1小时后，白细胞开始聚集并黏附至静脉内皮细胞，5～6小时后，白细胞覆盖整个内皮细胞表面。黏附的白细胞里，中性粒细胞占比例超过80%，其余以单核细胞为代表。激活的单核细胞表达组织因子，引起血液凝固和血管内纤维蛋白形成，这种纤维蛋白网通过结合整合素αMb2（Mac-1）促进白细胞的进一步堆积和激活。研究发现，在内皮细胞表面缺乏P-选择素的小鼠中，堆积至静脉壁的白细胞减少了几个数量级，由此可推测白细胞堆积依赖于静脉腔一侧内皮细胞上P-选择素的暴露。P-选择素表达于活化的内皮细胞和血小板表面，1992年在对狒狒的动静脉分流模型中研究中发现，抑制P-选择素的表达可以减少白细胞堆积和纤维蛋白沉积。
中性粒细胞（PMNs）被视为免疫系统的棋子。随着我们对免疫系统的不断了解及对动态细胞群的技术评估不断提高，PMNs的主要功能是先天免疫和宿主防御细菌，但在凝血中具有多方面的作用，在许多系统性疾病的病理生理学中起主要作用。PMNs参与DVT的形成早在几十年前就被发现，但最近研究揭示了PMNs在DVT形成的病理生理学中的重要作用。
在P-选择素和P-选择素糖蛋白配体1（PSGL-1）的参与下，PMNs游走堆积至激活的血管内皮细胞，开始活化并释放细胞核物质，形成网状的细胞外结构，称为PMNs胞外诱捕网（NETs）。NETs以DNA为骨架，其间镶嵌组蛋白、髓过氧化物酶、中性粒细胞弹性蛋白酶等具有杀菌和增加通透性作用的蛋白。NETs在静脉血栓中大量存在，这与DVT患者血浆内NETs生物学标志物升高是一致的[21]。对狭窄型DVT小鼠的研究发现，注射脱氧核糖核酸酶（DNase）I能够阻止NETs形成或破坏已经形成的NETs，最终可保护小鼠免受血栓形成，这说明NETs在DVT形成过程中的重要作用。堆积至静脉壁的血小板释放并暴露其表面的高迁移率蛋白1（HMGB1）及单核细胞也能够诱导形成NETs。
NETs可能致静脉血栓形成的机制是已经成为一个重要的研究领域。NETs可以通过以下几个途径支持DVT形成：①NETs可直接激活FⅫ促进凝血瀑布反应，降低机体抗凝活性。NETs激活FⅫ转变成FⅫa，FⅫa在不激活FⅪ的情况下，通过与纤维蛋白的直接作用产生凝血效应，同时促进补体系统的激活，产生的C3a和C5a可以促进血栓形成和血小板激活。②NETs内表达的组蛋白H4及组蛋白H3也可以触发血小板的活化。体外实验发现，NETs能够刺激血小板聚集及黏附，最终在体内导致血栓形成，这两种效应因组蛋白失活而被抑制。③vWF、纤维蛋白原及纤维连结蛋白等黏附蛋白可能与DNA/组蛋白相结合，为血小板和红细胞提供了可依附的支架，并不依赖于纤维蛋白的网状结构。④中性粒细胞弹性酶可诱发外源性凝血途径抑制剂（TFPI）和内皮细胞上血栓调节蛋白表达的降解和灭活，进一步促进血栓的形成。
TF是外源性凝血系统激活及纤维蛋白沉积的主要启动因子，而单核细胞是TF的主要来源。单核细胞通过产生微粒子参与DVT的形成。微粒子在单核细胞基因组被编码，在天然免疫系统的受体PRRs（模式分子识别受体，pattern recognition receptors，PRRs）刺激下释放，正常情况下生成很少。对狭窄型DVT模型研究中发现，髓系白细胞缺乏TF的情况下可完全阻止静脉血栓的形成，但并不影响白细胞的堆积。
血小板在DVT的形成过程中具有重要作用。当血流速度减慢后血小板会迅速堆积至静脉壁，这是由血小板受体GPIba与vWF结合所介导。同时，在血小板因子4的刺激下，整合素-2与PMNs作用生成NETs，促进DVT形成。血小板堆积也依赖于血小板细胞膜分子CLEC-2，CLEC-2是一种能与平足蛋白相结合的半记忆免疫感受器，平足蛋白是一种跨膜黏蛋白，在血栓形成过程中其表达明显上升。有报道称，血流速率降低导致低氧可诱导内皮细胞激活，使得内皮细胞与细胞之间连接更加松散，血小板渗透到内皮细胞间隙内，在这里CLEC-2和平足蛋白可能会发生相互作用。
除促凝作用外，堆积的血小板还提供重要的促炎反应，是损伤相关分子模式（DAMPs）的重要来源。DAMPs是在应激中产生的分子，是组织或细胞受到创伤、休克、缺血和再灌注损伤等因素刺激后释放到细胞或血液循环中的一类物质。当血小板堆积至静脉壁后使得核糖体蛋白HMGB1暴露，并在激活的血小板表面表达，通过RAGE、TLR2和TLR4启动免疫应答。随后HMGB-1介导的PMN激活，导致NETs形成及微血管血栓形成。HMGB-1在体内被血栓调节蛋白-凝血酶复合物裂解。研究发现，血小板源性HMGB1的缺乏可显著降低血栓大小及血栓的发生率。此外，在血栓形成的早期阶段，HMGB1可促进新生血小板的堆积及激活。在血栓形成过程中，NETs形成的增强以及血小板的增加将导致HMGB1进一步积累，促进DVT的形成。
DVT的形成与免疫具有重要的联系，在血栓形成阶段局部炎症的作用尤为重要。这为识别新的抗血栓靶点打开了新窗，因为免疫系统不会直接影响正常的止血，因此针对它不会导致过度出血，且目前多种抗炎药已经上市，因此可以测试其预防DVT的有效性。与抑制凝血机制相比，靶向作用于炎症通路引起出血并发症的可能性更小，因此，它可能是高危人群预防DVT形成的更为安全的替代疗法，对于该领域的进一步研究可能会提供重要的新的治疗选择。
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